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1.基本信息
(1)品系名称：NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Vst/Vst
(2)常用名：NPG必威
(3)背景：NOD
(4)毛色：白色
(5) 品系建立：NPG必威，是必威BetWay蘋果ios手机app软件下载自主研发的一系列高度免疫缺陷大必威模型之一，将获得的Il2rg基因敲除必威，回交到NOD-scid背景建立的高度免疫缺陷模型。使用该必威模型已经发表了一系列高水平研究论文[1~12]。
2.制作简介
首先构建了Il2rg基因打靶载体，在B6/129 F1背景的ES细胞上，筛选得到将Il2rg基因敲除的阳性打靶细胞（见图1）。通过囊胚注射的方法，获得了Il2rg基因敲除的ES嵌合必威。然后，将ES打靶必威，与NOD-scid必威回交，从后代中选择Il2rg因基敲除鼠，再与NOD-scid必威回交。通过12代的回交，获得并选择Il2rg-雄鼠和Il2rg+/-雌鼠交配，获得PrkdcscidIl2rg-/-必威。随后，NOD.PrkdcscidIl2rg-/- 必威按照近交系的方式扩繁生产。
图1. Il2rg 基因打靶策略示意图
3.质控检测和表型分析
NPG必威主要包括两个基因突变，（1）Prkdc基因的点突变，在84号外显子上，TAT→TAA，产生了一个无效的包含83AA的删短蛋白；（2）Il2rg基因必威，3-8外显子的编码区被删除。NPG必威的SNP分析结果见表1，与NOD-scid (NOD.CB17- Prkdcscid/NcrCrlVr)必威一致。
表1. NPG 和NOD-scid 必威SNP分析结果。
SNP ID | Chr-cM | Allele | NPG | NOD-scid | |
1 | RS8253473-SNP1 | 1-80 | V=A, F=C | F F | F F |
2 | RS13476104-SNP1 | 1-128 | V=C, F=T | V V | V V |
3 | RS13476435-SNP1 | 2-35 | V=A, F=T | F F | F F |
4 | RS13476730-SNP1 | 2-119 | V=A, F=T | V V | V V |
5 | RS13477470-SNP1 | 3-146 | V=A, F=G | V V | V V |
6 | RS13478001-SNP1 | 4-135 | V=C, F=T | V V | V V |
7 | RS13478215-SNP1 | 5-42 | V=A, F=C | F F | F F |
8 | RS13459087-SNP1 | 5-86 | V=A, F=G | F F | F F |
9 | RS13478818-SNP1 | 6-73 | V=C, F=G | F F | F F |
10 | RS3710839-SNP1 | 6-121 | V=A, F=G | V V | V V |
11 | RS3666902-SNP1 | 7-15 | V=T, F=C | VV | VV |
12 | RS8260975-SNP1 | 7-34 | V=A, F=C | V V | V V |
13 | RS13479791-SNP1 | 8-60 | V=A, F=G | F F | F F |
14 | RS4227276-SNP1 | 8-80 | V=C, F=T | F F | F F |
15 | RS8254841-SNP1 | 9-38 | V=A, F=T | F F | F F |
16 | RS13480385-SNP1 | 9-103 | V=C, F=T | V V | V V |
17 | RS13480546-SNP1 | 10-24 | V=C, F=T | F F | F F |
18 | RS13480803-SNP1 | 10-123 | V=C, F=T | V V | V V |
19 | RS13480933-SNP1 | 11-25 | V=C, F=G | V V | V V |
20 | RS3653651-SNP1 | 11-102 | V=C, F=T | F F | F F |
21 | RS13481624-SNP1 | 12-99 | V=C, F=G | F F | F F |
22 | RS13481852-SNP1 | 13-63 | V=A, F=C | V V | V V |
23 | RS13482131-SNP1 | 14-30 | V=C, F=T | V V | V V |
24 | RS13459176-SNP1 | 15-3 | V=A, F=C | V V | V V |
25 | RS4170048-SNP1 | 16-32 | V=C, F=G | V V | V V |
26 | RS13482843-SNP1 | 17-4 | V=C, F=T | V V | V V |
27 | RS13483295-SNP1 | 18-35 | V=G, F=T | V V | V V |
28 | RS13483601-SNP1 | 19-34 | V=A, F=G | F F | F F |
29 | RS13483739-SNP1 | X-40 | V=C, F=T | V V | V V |
30 | RS13483962-SNP1 | X-109 | V=A, F=C | F F | F F |
NOD(non-obese diabetes) 背景适宜人源细胞移植[13]；Prkdc基因突变，必威T、B细胞缺失[14,15]；Il2rg蛋白的gamma链被敲除，其NK细胞活力几乎丧失[16,17]。因而其基因检测和表型分析主要集中在4个方面：①NOD背景（SNP检测）；②Prkdc点突变（PCR检测；T、B细胞缺失的流式检测）；③Il2rg敲除（PCR检测，功能性NK细胞缺失的流式检测）；④细胞移植重建分析。
(1) NOD背景检测 ;
NPG必威制作使用的NOD-scid必威，其遗传检测数据见右上30个SNP(single nucleotide polymorphism)位点信息表，这些位点遗传标记分布于20条染色体。
(2) Prkdc点突变、Il2rg敲除和NOD背景（Sirpa基因）检测
Prkdc点突变必威， 1983年由福克斯蔡斯癌症中心（Fox Chase Cancer Centre）的Bosma等人发现[14,15]。Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，必威的T和B细胞缺失 ，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。Il2rg敲除必威表现为胸腺发育不全，NK细胞数量减少，活性丧失[16,17]。目前Prkdc点突变常用的检测方法为PCR检测；蛋白水平的检测比较方便的是流式分析其外周血中T、B淋巴细胞的含量。Il2rg敲除常用的检测方法为PCR检测；蛋白水平的检测比较方便的是流式分析其脾脏中NK细胞的含量和活性。NPG必威采用上述方法进行质控，结果见下图。
图2 Prkdc基因PCR检测 图3 Il2rg基因PCR检测
图4 NOD背景（Sirpa基因）检测
(3) T、B和NK细胞检测
图5 NPG必威缺失有功能的T、B和NK细胞。流式分析B6, Balb/c nude和NPG必威外周血中CD3+ CD4+ or CD3+CD8+ T 细胞 , B220+ B 细胞和NKp46+ NK 细胞的含量。
(4) 造血干细胞移植重建和肿瘤细胞移植数据
① NPG必威移植人造血干细胞效果显著优于NOD-scid必威。
图6 NPG和NOD-scid必威移植人造血干细胞，第12周时人CD45+细胞嵌合率分析。左图为移植后12周时外周血中人CD45+细胞比例的流式分析结果；右图为骨髓中人CD45+细胞的比例。
②人造血干细胞（HSCs）移植NPG必威高水平重建造血系统
图7 NPG必威移植人造血干细胞（HSCs）后，可以高水平重建造血系统。左图为将 5×104脐带血CD34+细胞通过骨髓移植入6-8周的NPG必威后检测结果; 右图为1×105脐带血CD34+细胞移植后16周在NPG必威脾脏中检测到高水平的人CD45+细胞
③人造血干细胞（HSCs）移植NPG必威后重建各系造血细胞比例检测
图8人造血干细胞（HSCs）移植NPG必威后获得各系造血细胞分化的高水平重建。上图显示的为将5×104脐带血CD34+细胞移植16周后，在NPG必威外周血中检测到高水平的人CD45+细胞（46.54%）、CD19+ B细胞（70.9%）、CD3+ T细胞（17.33%）和CD33+髓系细胞（8%）。
图9 人造血干细胞（HSCs）移植NPG必威后各系细胞重建。脐带血CD34+细胞移植NPG必威12周以及更长时间之后，人源造血细胞稳定重建，T细胞所占比例逐渐升高。
④NPG必威肿瘤免疫治疗的相关研究
图10 人肿瘤细胞移植NPG必威后更容易成瘤。上图为使用NPG必威和BALB/c裸鼠，皮下接种人黑色素瘤细胞A375SM后，活体成像的肿瘤示踪图，可见NPG必威成瘤，与裸鼠相比，大小更均匀，生长到一定体积需要的时间相对更短。
4. 应用领域
（1）人源细胞或组织移植
（2）肿瘤和肿瘤干细胞研究
（3）ES和iPS细胞研究
（4）造血和免疫学研究
（5）人类疾病感染模型研究
（6）人源化动物模型研发
5. 参考文献
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