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基因编辑类型
根据研究的不同目的，需要制备不同的的动物模型。当为了研究基因的功能时需要过表达或敲除相应基因。如果全身敲除目的基因会导致动物死亡时，或需要在特定的组织敲除基因时，可以制备条件敲除必威。为了建立基因突变模型时，制备点突变动物模型。制备基因人源化必威时，可以进行人源基因的替换。制备不同的动物模型，需采用相应的策略，才能成功获得目标模型。
基因敲除是研究基因功能的重要方法。传统ES打靶敲除方法，周期长，费用高。CRISPR/Cas9在基因敲除方面的优势：效率高，时间短，24天直接获得基因敲除必威。
技术一般的流程
设计合成gRNA→ 显微注射→ 必威出生检测。
技术优势或适合应用的研究
-效率高，可达90%的敲除效率，并且有一定纯合敲除比例。
-方便检测，从PCR条带的大小，容易区分是否发生敲除。
-时间短，24天获得基因敲除必威。
-不受敲除片段大小限制，从几十bp到Mb长度的DNA,都能有效敲除。
成功案例
图1：两个Grna切割位点之间的~550bp基因序列被敲除，PCR检测，相对于野生带773bp，发生敲除的鼠产生~220bp的条带（箭头指向的条带）。
当基因敲除会导致必威死亡时，需要条件敲除，才能获得成体必威用于研究。条件敲除一般使用Cre-loxp系统，其方法是在基因的关键区域的两侧，插入loxp。loxp必威制备好后，与Cre必威杂交，获得loxp纯合，Cre阳性的必威，这种必威在Cre的作用下，loxp发生重组，中间的序列被删除，达到敲除基因的目的。目前已经有数百种Cre工具必威，可以根据研究需要，购买或定制Cre工具鼠，在不同的组织器官，达到敲除目的基因。Cre融合ER/ERT2后，可以使用tamoxifen调控Cre入核，实现时间上的调控删除。
图1：通过CRISPR辅助，在关键外显子的两侧通过同源重组，插入两个loxp，在Cre的作用下，loxp之间的外显子被删除，实现基因条件敲除。
技术一般的流程
打靶载体设计→ 载体构建→ 显微注射(EPS打靶)→ 必威鉴定。
技术优势或适合应用的研究
-用于敲除致死的基因
-非致死基因，用条件敲除也可以在不同的组织，不同的时间敲除基因，获得更多的实验数据。
成功案例
图2：在关键外显子或非3整数倍的外显子两侧敲入loxp,在Cre的作用下，该区域被删除，导致基因敲除。
图3：设计Loxp插入位点的特异引物与同源臂外侧的引物，通过PCR，可以检测到两个loxp被正确敲入到目的位置，证明获得条件敲除必威。
随机转基因是一种经典的过表达基因必威制备策略，不同于靶向基因编辑，没有受到新兴基因编辑技术的影响。该方法通过将基因随机整合到基因组中，实现目的基因过表达。
技术一般的流程
过表达载体构建→ 显微注射→ 必威鉴定筛选→ 表达检测→ 品系建立。
图1：转基因载体和必威制备流程。
技术优势或适合应用的研究
-可以广谱，或组织特异过表达目的基因。
-多拷贝插入，比定点插入表达量更高。
-受整合位置影响，可能表达沉默，或者表达谱错误。
成功案例
图2：通过转基因载体特异的引物设计，检测到转基因阳性的必威，一般效率在10-20%。
定点转基因是将转基因表达载体敲入到Rosa26位点，该位点被证明是在所有组织细胞都活跃的区域，不会发生随机转基因中出现的转基因沉默的现象。常用来制作过表达或条件过表达必威。条件过表达是在目的基因前面插入loxp包围的Stop序列，阻止目的基因表达。该必威模型与Cre必威杂交，能够在Cre表达的组织中，删除Stop序列，从而使目的基因发生表达；过表达必威直接获得组成性基因表达必威。维通达的Rosa26位点的定点转基因系统，已经实现长达10kb的定点转基因。
图1：Rosa26位置敲入转基因表达载体，制备定点转基因必威.
基因敲入是指在基因组的特定位置插入一段DNA序列，例如给基因加GFP荧光标签标记蛋白，原位敲入制备Cre工具鼠等应用。1kb以下的小片段插入，CRISPR/Cas9效率较高。对于大片段的基因插入，需要使用ES，或者EPS制备策略才能保证项目周期和效率。
图1：把绿色荧光蛋白敲入目的基因的C端，融合表达，示踪目的基因。
技术一般的流程+图解
打靶载体设计→ 载体构建→ 显微注射(EPS打靶)→ 必威鉴定。
技术优势或适合应用的研究
-CRISPR用于小片段的基因敲入。
-ES/EPS用于大片段基因敲入。
-给基因加各种标签，原位敲入制备Cre工具鼠。
基因替换指，根据研究需要，将必威的基因替换为其它物种的基因。可以将基因的部分功能区，或者全基因进行替换。1kb以下的小片段替换，可以采用CRISPR/Cas9策略。对于大片段的基因替换，需要使用ES，或者EPS制备策略才能成功。
图1：用其它种系的基因，替换必威的基因片段。
技术一般的流程+图解
打靶载体设计→ 载体构建→ 显微注射(EPS打靶)→ 必威鉴定。
技术优势或适合应用的研究
-CRISPR用于小片段的基因替换。
-ES/EPS用于大片段基因替换。
3)基因人源化必威的制备，如PD1等免疫检查点人源化必威的制备。
图1 EPS小片段敲入效率高达90%。
图2 EPS系统对于长达20kb的大片段敲入，也具有很高的效率。
许多疾病由氨基酸突变引起，为了构建此类疾病模型，可以将必威的对应基因的位点进行突变。单链DNA在点突变方面有较高的成功率。
图1 单链DNA模板制备点突变必威。
图2 PCR扩增包含突变位点的序列，测序检测发生点突变的必威，目标碱基出现套峰，证明获得杂合突变必威。
技术一般的流程
gRNA设计→ 供体DNA合成→ 显微注射(EPS打靶)→ 必威鉴定。
技术优势或适合应用的研究
-氨基酸突变类必威疾病模型模拟
-CRISPR点突变效率相对较高
